Core Concepts
GeoCas9の認識ローブ(Rec)の構造、動態、およびガイドRNA結合を原子レベルで調整することで、GeoCas9の機能と特異性を微調整できる。
Abstract
本研究では、熱安定性の高いGeoCas9の認識ローブ(Rec)の構造と動態を詳細に解析した。Rec1とRec2のサブドメインを個別に発現・精製し、X線結晶構造解析とNMR分光法を用いて、Recの構造と多時間スケールの分子運動を明らかにした。
Rec2ドメインに2つの点変異(K267E、R332A)を導入したところ、Recの柔軟性が増大し、ガイドRNAとの結合親和性が低下した。しかし、これらの変異は全長GeoCas9の標的DNA切断活性にはほとんど影響を及ぼさなかった。一方、K267E/R332A二重変異体では、GeoCas9の標的特異性が若干向上した。
これらの結果は、GeoCas9のRecドメインの構造、動態、およびRNA結合を原子レベルで調整することで、その機能と特異性を微調整できることを示している。一方で、GeoCas9はSpCas9に比べて進化的に耐性が高く、単一の点変異では大きな影響を及ぼさないことも明らかになった。今後、さらなる変異導入によって、GeoCas9の機能と特異性をより精緻に制御できる可能性が示唆された。
Stats
GeoCas9のRec2ドメインのK267E変異体のCPMG緩和分散実験から得られた全体的な交換速度定数(kex)は376 ± 89 s-1であり、野生型(147 ± 41 s-1)や R332A変異体(142 ± 28 s-1)に比べて大きく増大していた。
MST実験によると、K267E GeoRecとR332A GeoRecのガイドRNAに対する親和性は、野生型GeoRecに比べてそれぞれ2倍、1.4倍低下していた。
Quotes
"GeoCas9のRecドメインの構造、動態、およびRNA結合を原子レベルで調整することで、その機能と特異性を微調整できる"
"GeoCas9はSpCas9に比べて進化的に耐性が高く、単一の点変異では大きな影響を及ぼさない"