斑馬魚的 Naa80 蛋白對於肌動蛋白的 N 端乙醯化和正常聽力至關重要

核心概念

Naa80 是一種在斑馬魚和人類中都能對肌動蛋白進行 N 端乙醯化的酶，而肌動蛋白的 N 端乙醯化對於體內正常的聽力至關重要。

摘要

介紹
肌動蛋白是真核細胞細胞骨架的關鍵組成部分，參與許多細胞功能。在動物細胞中，肌動蛋白經過特異的酶機制進行獨特的 N 端加工，以產生其成熟的酸性和乙醯化形式。這個成熟過程的最後一步涉及 N 端乙醯化，這是一種由人類 NAA80 催化的反應。在人類細胞系中，肌動蛋白的 N 端乙醯化在維持正常的細胞骨架動力學和細胞運動性方面起著至關重要的作用。肌動蛋白 N 端乙醯化的生理影響仍有待確定。在這裡，我們開發了一個斑馬魚 naa80 敲除模型，並確定 zNaa80 在體內會乙醯化肌肉和非肌肉肌動蛋白。我們對純化的 zNaa80 進行的體外研究揭示了其對乙醯化肌動蛋白 N 端的明顯偏好。有趣的是，缺乏肌動蛋白 N 端乙醯化的斑馬魚仍然存活，並表現出正常的發育、形態和行為。相比之下，攜帶致病性肌動蛋白變異的人類個體可能會出現肌張力低下和聽力障礙。雖然斑馬魚 naa80 耗盡沒有表現出任何明顯的肌肉缺陷或異常肌肉組織，但我們發現它們的內耳發育異常，例如耳石小和對聲音刺激的反應受損。總之，我們已經確定斑馬魚 Naa80 在體外和體內都能對肌動蛋白進行 N 端乙醯化，並且肌動蛋白的 N 端乙醯化對於體內正常的聽力至關重要。
結果
斑馬魚 Naa80 同源物在體外對酸性肌動蛋白型 N 端肽段表現出 N 端乙醯轉移酶活性
與其他動物一樣，斑馬魚也有幾種肌動蛋白，它們的 N 端序列各不相同。肌動蛋白的 N 端序列有細微的差異，但總是酸性的（圖 1）。I 類肌動蛋白（人類中的 β-肌動蛋白和 γ-肌動蛋白）在起始甲硫氨酸 (iMet) 後的 N 端有一段 3 個酸性氨基酸，而 II 類肌動蛋白（α-心臟 1a 和 1b、α-骨骼 1a 和 1b 以及 α-平滑肌）在 3-4 個酸性殘基的 N 端有 iMet 和半胱氨酸殘基。
不同發育階段和成體組織中 naa80 mRNA 的動態表達
為了深入了解 naa80 的可能功能，我們在不同的發育階段採用了整體原位雜交 (WISH)（圖 2A-D）和 RT-qPCR（圖 2E）來揭示 naa80 mRNA 的時空表達模式。值得注意的是，我們在受精後 1 小時 (hpf) 就檢測到 naa80 的表達（圖 2A），這表明 naa80 mRNA 具有母體分佈。到 24 hpf 時，naa80 mRNA 表現出普遍的表達，包括中樞神經系統、眼睛、耳囊和軀幹肌肉（圖 2B 和 B’）。隨後，在 48 和 72 hpf 時，naa80 的表達變得局限於大腦、眼睛和胸鰭芽（圖 2C、C’ 和 D）。RT-qPCR 結果支持了 naa80 在整個胚胎發育過程中的表達（圖 2E）。
naa80 -/- 斑馬魚沒有明顯的形態表型，發育正常
為了研究 zNaa80 的體內功能，我們構建了兩個推定的 naa80 基因敲除斑馬魚品系。通過 PCR 使用 naa80 特異性引物（見表 1）驗證了敲除等位基因，然後進行 Big Dye 測序或瓊脂糖凝膠電泳。敲除魚在形態上是正常的，並且發育正常（圖 3）。雄性 naa80 13del+/- 魚顯著短於對照組（p < 0.05）；然而，naa80 13del-/- 魚並不顯著短，因此 naa80 基因型不太可能是造成這種情況的原因。在所有其他比較中，體重和體長與同窩魚沒有差異，我們也沒有發現任何 naa80 +/- 或 -/- 魚特有的形態異常。
naa80 -/- 斑馬魚的細胞質和肌肉肌動蛋白的 N 端乙醯化受損
為了檢查 naa80 敲除斑馬魚中肌動蛋白的 N 端乙醯化狀態，我們解剖了骨骼肌和心臟組織，並在裂解之前對可溶性蛋白進行胰蛋白酶消化，然後通過 LC/MS 進行分析。我們發現心臟和骨骼肌樣本中的肽和蛋白數量顯著增加，肌動蛋白 N 端肽和總體肌動蛋白肽的數量也更多。在大多数 naa80 -/- 样本中没有检测到 N 端乙酰化的肌动蛋白；然而，在 10 个 naa80 5del/1in -/- 心脏样本中检测到少量 N 端乙酰化的细胞质肌动蛋白 2 (Ac-DDEI…)（图 4）。这可能是 Naa10 或其他 NAT 的残留 N 端乙酰化 (26, 27)，也可能是来自不同样本的残留或污染。尽管如此，几乎所有 N 端乙酰化在 naa80 -/- 鱼中似乎都消失了。
naa80-/- F0 敲除 (KO) 斑馬魚表現出與聽力相關的缺陷
先前的一項研究表明，具有 NAA80 雙等位基因錯義變異的人類個體表現出肌動蛋白 N 端乙醯化減少和聚合肌動蛋白增加，這可能導致高頻聽力損失 (16)。然而，尚未在基因突變模型中進行直接的聽力相關評估。具體而言，異常乙酰化的肌動蛋白如何在體內導致聽力損失表型仍不清楚。
討論
N 端乙酰化可能是真核生物中最常見的蛋白質修飾，因為 50-90% 的真核生物蛋白質組都經過了 N 端乙酰化 (23, 32, 33)。N 端乙酰化的功能影響可能因蛋白質而異，包括蛋白質折疊、穩定性、降解、複合物形成和亞細胞靶向 (34, 35)。最近的全球分析發現，防止蛋白質降解是多細胞真核生物中蛋白質 N 端乙酰化的主要功能 (36-38)。真核生物中大多數的 N 端乙酰化事件是由一組五種保守的 N 端乙酰轉移酶 (NAT)（NatA-NatE）催化的，它們以共翻譯的方式起作用 (35, 39)。此外，最近在植物和動物界都發現了翻譯後 NAT 酶 (8, 26, 40, 41)。目前已知的兩種翻譯後動物界 NAT 是 NatF/NAA60（乙酰化跨膜蛋白 (25, 42)）和 NatH/NAA80（乙酰化肌動蛋白 (8-10)）。NAT 機制和 N 端乙酰化組尚未在魚類中得到充分研究。目前只對 NatA 和 NatC 進行了基礎研究 (27, 43)。在這裡，我們研究了肌動蛋白（動物中最常見的細胞蛋白，具有多種功能）的 N 端乙酰化的機制和影響。

統計資料

在人類 HAP1 細胞和其他哺乳動物細胞中，大約 100% 的細胞質肌動蛋白異構體（人類中的 β-肌動蛋白和 γ-肌動蛋白）都經過了 N 端乙醯化。
在 NAA80 敲除細胞中，這種乙醯化會消失。
NAA80 敲除細胞的遷移速率增加、細胞大小增加、高爾基體斷裂以及絲狀偽足和片狀偽足數量增加。
兩名患有 NAA80 致病性變異的兄弟表現出進行性高頻聽力損失、顱面畸形、發育遲緩以及軀幹和四肢輕度肌肉无力。
測序顯示，這些患者的 NAA80 中存在 c.389T>C (Leu130Pro) 變異，該變異是純合的，導致 NAA80 蛋白質不穩定，肌動蛋白 N 端乙醯化水平降低至對照細胞的約 50%。
在 naa80 -/- 樣本中，幾乎沒有檢測到 N 端乙醯化的肌動蛋白。
在 naa80 +/+ 和 +/- 樣本中，我們發現了 N 端乙醯化的肌動蛋白 N 端，而幾乎沒有發現未乙醯化的肌動蛋白 N 端。
我們從中得出結論，一個功能性 naa80 等位基因足以完成肌動蛋白的 N 端乙醯化。

從以下內容提煉的關鍵洞見

Naa80 is required for actin N-terminal acetylation and normal hearing in zebrafish

by Ree,R., Lin,... 於 www.biorxiv.org 03-17-2024

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.17.585386v1

深入探究

除了聽力損失外，naa80 -/- 斑馬魚是否還表現出其他與人類 NAA80 致病性變異相關的表型，例如顱面畸形或發育遲緩？

根據研究結果，除了聽力損失 (表現為耳石較小、毛細胞束減少和驚嚇反應降低) 外，naa80 -/- 斑馬魚沒有表現出與人類 NAA80 致病性變異相關的其他表型，例如顱面畸形或發育遲緩。研究人員觀察到 naa80 -/- 斑馬魚的形態和發育與野生型斑馬魚沒有顯著差異。
然而，值得注意的是，這項研究主要集中在觀察 naa80 -/- 斑馬魚的總體形態和發育，以及聽覺系統的具體分析。 需要進一步研究來檢查 naa80 -/- 斑馬魚中是否存在其他細微的表型，例如行為或生理上的變化，這些變化可能與人類 NAA80 致病性變異相關。

是否存在其他尚未發現的酶或途徑可以補償 naa80 -/- 斑馬魚中肌動蛋白 N 端乙醯化的缺失？

目前的研究結果強烈表明，Naa80 是斑馬魚中 I 類和 II 類肌動蛋白 N 端乙酰化的主要酶。 naa80 -/- 斑馬魚中幾乎所有肌動蛋白 N 端乙酰化都消失了，這表明其他酶或途徑不太可能完全補償 Naa80 的缺失。
然而，研究中觀察到 naa80 -/- 斑馬魚心臟樣本中存在少量 N 端乙酰化的細胞質肌動蛋白 2 (Ac-DDEI…)，這表明可能存在其他 NAT 酶（例如 Naa10）在 naa80 缺失的情況下發揮有限的冗餘作用。 此外，肌動蛋白功能也受到其他翻譯後修飾和肌動蛋白結合蛋白 (ABP) 的調節，這些修飾和蛋白可能在一定程度上補償 Naa80 缺失的影響。
需要進一步研究來徹底調查 naa80 -/- 斑馬魚中是否存在其他酶或途徑可以促進肌動蛋白 N 端乙酰化，以及這些潛在機制的貢獻程度。

這項研究的結果對於開發治療人類聽力損失和其他與肌動蛋白相關疾病的新療法有何意義？

這項研究證明了肌動蛋白 N 端乙酰化在斑馬魚聽力中的關鍵作用，這為開發治療人類聽力損失和其他與肌動蛋白相關疾病的新療法提供了重要的新見解。

首先，該研究強調了 Naa80 作為治療靶點的潛力。開發針對 Naa80 並增強其活性的藥物可能為 NAA80 功能缺陷或肌動蛋白 N 端乙酰化減少相關的聽力損失提供新的治療策略。
其次，了解 naa80 -/- 斑馬魚中聽力損失的具體機制，例如毛細胞發育或功能的缺陷，可以確定其他潛在的治療靶點。
最後，斑馬魚作為一種遺傳易處理的模式生物，為進一步研究肌動蛋白 N 端乙酰化在聽覺系統中的作用以及篩選潛在治療藥物提供了一個有價值的平台。
然而，重要的是要注意，斑馬魚和人類聽覺系統之間存在差異，因此在將這些發現轉化為人類治療方法時必須謹慎。