シクリック ヌクレオチド結合ドメインを持つイオンチャネルの配位子結合による構造変化の時間分解遷移金属 FRET による解明

Concepts de base

シクリック ヌクレオチド結合ドメインを持つイオンチャネルSthKのC末端領域の構造変化と自由エネルギー変化を、定常状態および時間分解遷移金属 FRET 実験により明らかにした。cAMPは大きな構造変化と自由エネルギー変化を引き起こすのに対し、cGMPは部分アゴニストとして弱い効果しか示さないことを示した。また、オリゴマー化や塩濃度の変化がこれらの構造変化と自由エネルギー変化に影響することを明らかにした。

Résumé

本研究では、シクリック ヌクレオチド結合ドメイン (CNBD) を持つイオンチャネルSthKのC末端領域の構造変化と自由エネルギー変化を、定常状態および時間分解遷移金属 FRET 実験により解析した。

まず、SthKC末端断片にドナー蛍光色素Acdとアクセプター金属イオンを導入し、定常状態 tmFRET 実験を行った。その結果、cAMPの結合により大きな構造変化が起こり、一方でcGMPは部分アゴニストとして弱い効果しか示さないことが明らかになった。

次に、時間分解 tmFRET 実験により、SthKC末端断片の構造変化の分布を詳細に解析した。2つのガウス分布の和でフィッティングした結果、アポ状態では12%が活性状態にあり、cAMPでは活性状態のみ、cGMPでは34%が活性状態にあることが分かった。これらの結果から、4状態モデルに基づいて自由エネルギー変化を算出した。cAMPでは大きな自由エネルギー変化を示すのに対し、cGMPは部分アゴニストとして弱い自由エネルギー変化しか示さないことが明らかになった。

さらに、塩濃度の変化がこれらの構造変化と自由エネルギー変化に影響することも示された。高塩濃度条件下ではcGMPの活性化が過大に評価されていたが、生理的な低塩濃度条件下では活性化が抑制されることが分かった。

本研究は、時間分解 tmFRET 法が CNBD チャネルの構造変化と自由エネルギー変化を詳細に解析する強力な手法であることを示している。また、SthKのC末端領域の構造変化とその調節機構の理解を深めるとともに、CNBD チャネルの機能制御に関する知見を提供している。

Stats

SthKチャネルのcAMP濃度依存的な活性化のHill係数は2.9±0.2
SthKチャネルのcGMP濃度依存的な活性化は非常に弱い(0.2%±0.3%)
アポ状態のSthKC末端断片の12%が活性状態
cAMPでは100%が活性状態
cGMPでは34%が活性状態
低塩濃度条件下ではcGMPの活性化が抑制される(ΔΔΔGcGMP = 0.35 kcal/mol)

Citations

"cAMP binding produces large structural changes, with a very favorable ΔΔG."
"In contrast to cAMP, cGMP behaved as a partial agonist and only weakly promoted the active state."
"Furthermore, we assessed the impact of protein oligomerization and ionic strength on the structure and energetics of the conformational states."

Idées clés tirées de

Ligand-Coupled Conformational Changes in a Cyclic Nucleotide-Gated Ion Channel Revealed by Time-Resolved Transition Metal Ion FRET

by Eggan,P., Go... à www.biorxiv.org 04-27-2024

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.04.25.591185v1

Questions plus approfondies

SthKチャネルのC末端以外の領域(膜貫通領域やN末端)がどのように構造変化と自由エネルギー変化に寄与しているか?

SthKチャネルのC末端以外の領域、特に膜貫通領域やN末端は、リガンド結合による活性化に重要な役割を果たしています。これらの領域は、リガンド結合後の構造変化と自由エネルギー変化に直接関与し、チャネルの活性化に寄与します。膜貫通領域は、リガンド結合によって誘導される構造変化を伝達し、チャネルの開口を促進します。一方、N末端は、リガンド結合後の構造変化を受けて、さらなる構造変化や相互作用を引き起こし、チャネルの活性化に寄与します。これらの領域の構造変化と自由エネルギー変化は、CNBDチャネルの機能やアロステリック調節の理解に不可欠です。

cGMPが部分アゴニストとして作用する分子機構はどのようなものか?

cGMPが部分アゴニストとして作用する分子機構は、SthKチャネルのC末端領域における構造変化とエネルギー変化に関連しています。cGMPは、cAMPと同様にCNBDに結合し、Cヘリックスをβ-ロールに近づける構造変化を引き起こします。しかし、cGMPはcAMPと比較してチャネルの活性化を弱める部分的な効果しか持ちません。この部分アゴニストの作用は、cGMPがCNBDに結合した際に引き起こす構造変化が、cAMPと比較してより少ない活性状態への移行をもたらすためです。したがって、cGMPが部分アゴニストとして作用する分子機構は、CNBDチャネルの構造変化とエネルギー変化によって説明されます。

CNBD チャネルの生理的機能を理解するためには、どのような実験系や解析手法が必要か?

CNBDチャネルの生理的機能を理解するためには、複数の実験系や解析手法が必要です。まず、X線結晶構造解析やクライオ電子顕微鏡法を使用して、チャネルの構造を高分解能で解析することが重要です。これにより、リガンド結合時の構造変化やドメイン間の相互作用を理解することができます。さらに、電気生理学的手法を用いて、チャネルの電気活性やリガンド結合による活性化を評価することが重要です。また、時間分解tmFRETなどの分子間相互作用を解析する手法を用いて、リガンド結合による構造変化やエネルギー変化を詳細に調査することが不可欠です。これらの実験系や解析手法を組み合わせることで、CNBDチャネルの生理的機能やアロステリック調節メカニズムを包括的に理解することが可能となります。