厚い組織の深部における高解像度3D構造化照明顕微鏡イメージング

Core Concepts

適応光学を組み込んだ新しい上向き型3D構造化照明顕微鏡システムにより、130 µmの深さまで高品質な3D超解像イメージングが可能になった。

Abstract

本研究では、適応光学を組み込んだ新しい上向き型3D構造化照明顕微鏡システム「Deep3DSIM」を開発した。このシステムにより、これまで困難だった厚い組織や複雑な生物試料の深部(最大130 µm)まで高品質な3D超解像イメージングが可能になった。
Deep3DSIMの主な特徴は以下の通り:

上向き型の光学系を採用し、試料操作(マイクロインジェクション、電気生理学測定など)が可能
適応光学を用いて球面収差や試料由来の収差を補正
リモートフォーカシング機能により、試料や対物レンズを動かすことなく迅速に焦点深度を変更可能
マルチチャンネル、高速3D時系列撮影が可能
これらの機能により、これまで困難だった厚い生物試料の深部イメージングが可能になった。具体的には、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部や脳、ショウジョウバエ胚の細胞分裂過程などを高解像度で撮影することに成功した。
本システムの設計は汎用性が高く、上向き型だけでなく倒立型の3D-SIMシステムにも適用可能である。適応光学とリモートフォーカシングの組み合わせにより、深部イメージングの精度と撮影速度が大幅に向上した。この技術は、生物学分野の様々な応用に役立つと期待される。

Stats

100 nmビーズを用いた測定では、AO-SIMモードで176 nmの空間分解能が得られた。
COS-7細胞のマイクロチューブ染色では、ワイドフィールドモードで330 nmの分解能に対し、SIMモードでは187 nmの分解能が得られた。
ショウジョウバエ幼虫脳の130 µm深部では、AOなしでは著しい収差によりサンプル構造が歪んでいたが、AOを用いることで200 nmの分解能が維持された。

Quotes

"AO補正により、130 µmの深さでも200 nmの分解能を維持できた。一方、AOなしでは同じ深さでは試料構造が大きく歪んでしまった。"
"リモートフォーカシングと組み合わせたマルチポジションAO補正により、深部でも高コントラストで高解像度の3D-SIMイメージングが可能になった。"

Key Insights Distilled From

Deep super-resolution imaging of thick tissue using structured illumination with adaptive optics

by Wang,J., Sto... at www.biorxiv.org 12-22-2023

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.21.572818v2

Deeper Inquiries

質問1

ピエゾステージを用いずにリモートフォーカシングのみで焦点深度を変更する場合の課題は何か?
リモートフォーカシングを使用して焦点深度を変更する際の課題の1つは、デフォーマブルミラー（DM）の応答性に関する問題です。特に、DMにはクリープ効果があり、形状が変化する速度に応じて応答が異なる可能性があります。このクリープ効果は、デバイスの動的特性に関連しており、特にAlpao DM69-15の場合、この効果が見られます。したがって、実際の応答は、DMの形状がどのくらい速く変化するかに関連するスケーリングファクターによって異なる可能性があります。このスケーリングファクターを決定するためには、ピエゾステージを参照として使用してサンプルをビーズのZ方向に移動させ、基準値を提供する必要があります。リモートフォーカシングとピエゾステージZポイントの両方のスロープを関連付けて、スケーリングファクターを導出します。このようなスケーリングファクターの決定は、Alpao DM69-15内で高い精度で線形応答を達成しますが、精度が不足していることがわかります。この問題は、デバイスの動的特性に関する詳細は、補足情報に詳述されています。

質問2

適応光学を用いた収差補正では、局所的な収差の変化にどのように対応できるか?
適応光学を使用した収差補正では、局所的な収差の変化に対応するために、複数の位置で収差を測定し、その後、これらの測定値を補間して中間の位置での補正を計算します。この手法は「マルチポジション適応光学補正」と呼ばれ、厚い試料内の光学的歪みを補償するために使用されます。具体的には、サンプルの上部と下部で収差を測定し、その後、これらの位置での補正Zernike係数をフィットして、選択されたボリューム内のすべてのZ位置で必要な補正を計算します。このアプローチにより、ボリューム内のすべてのセクションで事前に計算された補正パターンが生成されます。これらのパターンは、画像取得前に事前に計算され、画像取得中にTTLトリガーが使用されて、すべてのキューイングされたパターンをサイクルさせ、ハードウェアの残りの部分と同期させます。

質問3

本手法を応用して、生物試料の深部における機能イメージングを行うにはどのような課題があるか?
本手法を応用して、生物試料の深部における機能イメージングを行う際には、いくつかの課題に直面する可能性があります。まず、生きた試料の場合、イメージング中に構造が変化する可能性があるため、高速なデータ取得が必要です。また、生体試料を通してイメージングすることで、固定試料よりもより著しい収差が発生するため、収差補正がより重要になります。さらに、生物試料の厚さによっては、収差が異なるため、異なる深さのセクションで収差補正を変化させる必要があります。このような課題に対処するためには、高速なデータ取得、効果的な収差補正、および深部での収差補正の変化に対応する手法が必要です。また、生物試料の動的なプロセスを捉えるためには、高い空間分解能と時間分解能が必要であり、これらの要件を満たすためには、ハードウェアとソフトウェアの両面での改善が不可欠です。