ヒト由来の修飾のない転写物を用いたナノポア直接RNA解析のための多細胞性IVT

Concetti Chiave

ナノポア直接RNA解析における正確な RNA 修飾検出のためには、修飾のない転写物を負の対照として使用することが重要である。本研究では、6つの不死化ヒト細胞株から得られた修飾のない IVT 転写物データセットを提供し、これらのデータを RNA 修飾解析に活用する方法を示した。

Sintesi

本研究では、ナノポア直接RNA配列(DRS)を用いて、6つの不死化ヒト細胞株(A549、HeLa、HepG2、Jurkat、NTERA、SH-SY5Y)から得られた修飾のないin vitro転写(IVT)転写物データセットを作成した。

データの特徴は以下の通り:

• 各細胞株から1.3 - 4.9百万の主要アラインメントリードが得られた
• 全データセットをプールした"panIVT"では、ヒトタンパク質コード遺伝子の85.69%がカバーされた
• IVTデータとGRCh38リファレンスゲノムとの比較により、系統的な不一致の位置を特定し、3つのカテゴリー(既知のバリアント、低信頼9-merの不一致、その他の不一致)に分類した
• 生物学的DRSデータとIVTデータの発現量(TPM)の相関が高いことから、IVTデータが生物学的データの適切な負の対照となることが示された
• 特定の位置での不一致の有無を確認するためのサンガーシーケンシングなどの正確な検証が重要であることを示した
• 本データセットは、RNA修飾解析のための負の対照として活用でき、解析の計算負荷を軽減するためのイベントアラインデータも公開している

Statistiche

各細胞株のDRSリード数は1.3 - 4.9百万
panIVTデータセットでは、ヒトタンパク質コード遺伝子の85.69%がカバーされている
HeLaデータセットの30%不一致しきい値では、62,708個の不一致が同定された

Citazioni

"ナノポア直接RNA解析における正確なRNA修飾検出のためには、修飾のない転写物を負の対照として使用することが重要である。"
"本研究では、6つの不死化ヒト細胞株から得られた修飾のないIVT転写物データセットを提供し、これらのデータをRNA修飾解析に活用する方法を示した。"
"特定の位置での不一致の有無を確認するためのサンガーシーケンシングなどの正確な検証が重要である。"

Approfondimenti chiave tratti da

Multicellular, IVT-derived, unmodified human transcriptome for nanopore-direct RNA analysis

by McCormick,C.... alle www.biorxiv.org 04-07-2023

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.04.06.535889v2

Domande più approfondite

IVTデータの生成過程でどのような系統的な誤差が生じる可能性があり、それらをどのように最小限に抑えることができるか

IVTデータの生成過程において、系統的な誤差はいくつかの要因によって引き起こされる可能性があります。例えば、逆転写酵素やポリメラーゼによるIVT中のエラー、シーケンシング関連のエラー、ベースコーリングのエラー、アラインメントのエラーなどが挙げられます。これらの誤差がIVTデータセットに生じる場合、RNA修飾解析において混乱を招く可能性があります。これらの系統的な誤差を最小限に抑えるためには、以下のような対策が考えられます。

IVTデータセットにおいて、GRCh38リファレンスゲノムとの一致率を確認し、位置ごとにミスマッチの割合を特定する。
30%以上のミスマッチがある位置を特定し、Ensemblによって既知の変異か、低信頼度の9マー領域でのミスマッチか、その他のカテゴリーに分類する。
これらのミスマッチが生じる位置をRNA修飾解析から除外し、信頼性の高い結果を得るためのフィルタリングを行う。
これらの対策を実施することで、IVTデータセットにおける系統的な誤差を最小限に抑え、正確なRNA修飾解析を行うことが可能となります。

IVTデータと生物学的データの差異を生み出す要因は何か、また、それらの差異がRNA修飾解析にどのような影響を及ぼすか

IVTデータと生物学的データの差異は、いくつかの要因によって引き起こされます。IVTデータは、生物学的サンプルから得られるRNAを逆転写して合成する過程で、元のRNAの修飾が消失するため、生物学的データと比較して異なるシーケンスが生成される可能性があります。これらの差異がRNA修飾解析に与える影響は重要であり、以下のような点が考えられます。

IVTデータの生成過程で生じるミスマッチや誤差が、RNA修飾サイトの誤検出や解釈を困難にする可能性がある。
IVTデータと生物学的データの一貫性が低い場合、正確なRNA修飾解析が妨げられる可能性がある。
IVTデータにおける系統的な誤差が生じる位置を正しくフィルタリングしないと、誤った修飾サイトが同定される可能性がある。
これらの要因を考慮すると、IVTデータと生物学的データの差異を正確に理解し、適切なフィルタリング手法を用いてRNA修飾解析を行うことが重要です。

本研究で提示した手法は、他の生物種のRNA修飾解析にも適用可能か、また、どのような課題が考えられるか

本研究で提示した手法は、他の生物種のRNA修飾解析にも適用可能ですが、いくつかの課題が考えられます。例えば、異なる生物種のRNAには種固有の修飾パターンや特性が存在するため、既存のIVTデータセットをそのまま他の生物種に適用することは適切ではありません。そのため、他の生物種においても適切なIVTデータセットを生成し、種特異的な修飾解析手法を構築する必要があります。さらに、異なる生物種間でのRNA修飾の多様性や解釈の複雑さにより、解析手法やツールの最適化が課題となる可能性があります。したがって、他の生物種におけるRNA修飾解析には、種特異的な課題に対応するための綿密な検討と手法の最適化が必要となります。